Assembling life : models, the cell, and the reformations of biological science, 1920-1960

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NMR-spektroskopic study on the interaction of small molecules with the cell-cycle protein CDC25A

Viele verschiedene Funktionen der Zelle werden durch posttranslationale Modifikationen von Proteinen reguliert. Die reversible Phosphorylierung der OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der Möglichkeiten die Aktivität von Proteinen an- und abzuschalten und Interaktion mit Bindungspartnern zu ermöglichen oder zu verhindern. Die Phosphatase CDC25A übernimmt eine zentrale Rolle in der Steuerung des Zellzyklus, unterliegt selbst wiederum einer differenzierten Kontrolle durch Änderung des Expressionslevel, Phosphorylierung und Lokalisation innerhalb der Zelle. Da eine Überfunktion von CDC25A mit einer Vielzahl von verschiedenen Krebserkrankungen assoziiert ist, wird die Entwicklung starker und selektiver Inhibitoren, die auch in vivo wirksam sind, vorangetrieben. Die strukturellen Grundlagen selektiver Inhibition sind allerdings noch unzureichend erforscht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine erfolgreiche Durchführung von NMR-Experimenten gelegt, für die Proteinproben mit hoher Konzentration und Langzeitstabilität benötigt werden. CDC25A kann nicht in der vollen Länge exprimiert werden und wäre als Vollkonstrukt auch zu groß, um effektiv per NMR untersuchbar zu sein. Durch Erzeugung diverser Konstrukte der katalytischen Domäne von CDC25A konnte ein Expressionslevel erreicht werden, der die Erzeugung ausreichender Mengen an Protein praktikabel macht. Neben des oftmals geringen Expressionslevels ist ein weiteres Problem bei NMR-spektroskopischen Untersuchungen vieler Phosphatasen deren geringe Stabilität während der Aufreinigung und in der endgültigen Probe. Durch Optimierung der Pufferbedingungen für den Zellaufschluss in Bezug auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Kations per „Incomplete Factorial Design“ konnte die Ausbeute an löslichem Protein erheblich gesteigert werden. Die Verwendung dieser Pufferbedingungen während der ersten Aufreinigungsschritte verminderte auch die Tendenz des Proteins während der Chromatografie auszufallen. Die Zusammensetzung des Puffers für die endgültige NMR-Probe wurde schließlich durch das aus der Kristallografie entlehnte Verfahren der Dampfdiffusion ebenso in Hinblick auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Anions optimiert. Unter diesen optimierten Pufferbedingungen wurde die katalytische Aktivität des Proteinkonstrukts anhand der Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat nachgewiesen. Acht Substanzen wurden auf Inhibition dieser katalytischen Aktivität getestet. Das natürliche Substrat Phosphotyrosin zeigte eine kompetitive Hemmung, zwei starke und ein schwacher Inhibitor zeigten entsprechend verminderte Reaktionsraten. Von den restlichen 4 Substanzen (Inhibitoren anderer Protein-Tyrosin-Phosphatasen und strukturelle Verwandte) zeigten 3 weitere eine starke Wirkung. Diese hohe Promiskuität gegenüber Inhibitoren stellt ein großes Problem für die strukturgetriebene Wirkstoffentwicklung bei CDC25A und generell aller Phosphatasen dar. Nach Erhalt der fertigen Proben zeigten erste 2D-NMR-Spektren eine geringer als zu erwartende Zahl von Signalen und starke Überlappungen der sichtbaren Signale. Um auszuschließen, das Dimerisierung oder unspezifische Aggregation hierfür verantwortlich sind, wurden DOSY-Spektren gemessen. Aus der Eigendiffusionsrate ergibt sich ein hydrodynamischer Radius, der mit durch HYDROPRO simulierten Werten übereinstimmt und sich deutlich von dem des putativen Dimers absetzt. Daher wird davon ausgegangen, dass die Signalverluste im NMR nicht durch Dimerisierung oder Aggregation ausgelöst werden. Um die Bindung von Inhibitoren auch durch NMR-Spektroskopie nachzuweisen, wurden Saturation-Transfer-Difference-Experimente (STD) durchgeführt. In diesen war aber sowohl für das natürliche Substrat Phosphotyrosin als auch für alle im Enzymtest aktiven Inhibitoren kein Effekt nachweisbar. Dies weist auf eine sehr hohe koff-Rate der Bindung an das Protein hin oder auf eine irreversible chemische Modifikation des aktiven Zentrums, die bis zum Zeitpunkt der Messung bereits abgeschlossen war. Für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung werden spezifische Interaktionspunkte auf der Proteinoberfläche gesucht. Hierfür wurden 15N-HSQC-Spektren mit und ohne Bindungspartner gemessen und die Veränderungen der chemischen Verschiebung bestimmt („chemical shift perturbation“). Es konnten für Phosphotyrosin und die beiden starken Inhibitoren BN82002 und NSC663284 signifikante Veränderungen nachgewiesen werden. Für alle drei Moleküle gab es sowohl komplett einzigartige Veränderungen als auch paarweise übereinstimmende als auch ein Signal das für alle 3 übereinstimmt. Neben den Inhibitoren wurden drei Peptide auf spezifische Interaktion getestet. Das erste entspricht der Zielsequenz des natürlichen Substrats CDK, die anderen beiden sind Teile der Sequenz von CDK an einer nachgewiesenen als auch einer putativen sekundären Interaktionsfläche der beiden Proteine. Auch für die drei Peptide konnten wie für die Inhibitoren individuelle als auch übereinstimmende Signalveränderungen nachgewiesen werden. Als Voraussetzung für die Bestimmung der Oberflächenkontakte, die für die spezifische Bindung von Substrat, Inhibitoren und Interaktionspeptiden nötig sind, wird eine Zuordnung der Signale des 15N-HSQC-Spektrums zu den Aminosäureresten des Proteins benötigt. Hierzu wurden 3D-Tripelresonanz-NMR-Experimente an 15N, 13C-markierten Proben (zusätzlich auch noch 2H-markierte Proben zur Unterdrückung von Relaxationseffekten) durchgeführt. Um die Zuordnung zu unterstützen wurden außerdem Proben mit individuell 15N-markierten Aminosäuren hergestellt, um einem Signal im HSQC zumindest den Typ der Aminosäure zuordnen zu können. Aufgrund der trotz Pufferoptimierung, Deuterierung des Proteins und verringerter Signalüberlagerung in den Spektren der individuell markierten Proben zu geringen Anzahl an Signalen konnten nur kurze Bereiche der Aminosäuresequenz zugeordnet werden. Aufgrund dieser Basis konnte kein aussagekräftiges Mapping erzielt werden.The catalytic domain of cell-cycle proteintyrosinephosphatase CDC25A was expressed isotope-labelled and the NMR-conditions optimised. The interaction with small molecule inhibitors and short peptides derived from a natural protein substrate was studied by NMR-Spectroscopy

Aggregation of variables and system decomposition: Applications to fitness landscape analysis

In this paper we present general results on aggregation of variables, specifically as it applies to decomposable (partitionable) dynamical systems. We show that a particular class of transition matrices, namely, those satisfying an equitable partitioning property, are aggregable under appropriate decomposition operators. It is also shown that equitable partitions have a natural application to the description of mutation-selection matrices (fitness landscapes) when their fitness functions have certain symmetries concordant with the neighborhood relationships in the underlying configuration space. We propose that the aggregate variable descriptions of mutation-selection systems offer a potential formal definition of units of selection and evolution

Simon-Ando decomposability and fitness landscapes

In this paper, we investigate fitness landscapes (under point mutation and recombination) from the standpoint of whether the induced evolutionary dynamics have a “fast-slow” time scale associated with the differences in relaxation time between local quasi-equilibria and the global equilibrium. This dynamical hevavior has been formally described in the econometrics literature in terms of the spectral properties of the appropriate operator matrices by Simon and Ando (Econometrica 29 (1961) 111), and we use the relations they derive to ask which fitness functions and mutation/recombination operators satisfy these properties. It turns out that quite a wide range of landscapes satisfy the condition (at least trivially) under point mutation given a sufficiently low mutation rate, while the property appears to be difficult to satisfy under genetic recombination. In spite of the fact that Simon-Ando decomposability can be realized over fairly wide range of parameters, it imposes a number of restriction on which landscape partitionings are possible. For these reasons, the Simon-Ando formalism does not appear to be applicable to other forms of decomposition and aggregation of variables that are important in evolutionary systems

Privacy-Preserving Incentive Systems with Highly Efficient Point-Collection

Incentive systems (such as customer loyalty systems) are omnipresent nowadays and deployed in several areas such as retail, travel, and financial services. Despite the benefits for customers and companies, this involves large amounts of sensitive data being transferred and analyzed. These concerns initiated research on privacy-preserving incentive systems, where users register with a provider and are then able to privately earn and spend incentive points. In this paper we construct an incentive system that improves upon the state-of-the-art in several ways: – We improve efficiency of the Earn protocol by replacing costly zero-knowledge proofs with a short structure-preserving signature on equivalence classes. – We enable tracing of remainder tokens from double-spending transactions without losing backward unlinkability. – We allow for secure recovery of failed Spend protocol runs (where usually, any retries would be counted as double-spending attempts). – We guarantee that corrupt users cannot falsely blame other corrupt users for their double-spending. We propose an extended formal model of incentive systems and a concrete instantiation using homomorphic Pedersen commitments, ElGamal encryption, structure-preserving signatures on equivalence classes (SPS-EQ), and zero-knowledge proofs of knowledge. We formally prove our construction secure and present benchmarks showing its practical efficiency